A kényelmes valós idejű PCR-gépek optimalizálása

Ha ez valós idejű fluoreszcencia kvantitatív PCR-rel a vírus mennyiségi meghatározásához és az SNP genotípusához, akkor a lehető legmagasabb specifitással rendelkező PCR-gépre van szükségünk; Ha ez kórokozó és mRNS kimutatása, akkor nagy érzékenységi PCR -gépre van szükségünk , tehát hogyan kell optimalizálnunk ezt a PCR -gépet?

Itt van a tartalomlista:

l A PCR gép amplifikációs hatékonyságának javítása

L valós idejű PCR-gép alapozók használata az általános PCR-hez

A PCR gép amplifikációs hatékonyságának javítása

To improve the PCR machine amplification efficiency, specificity, and sensitivity, we can optimize the real-time fluorescence quantitative PCR machine for the experiment through a series of measures. Az első a célsorozat kiválasztása.

Az 1. pont, a kényelmes valós idejű PCR-gép célszekvenciájának megválasztása, megfelelő hosszúság, 50–150 bp között. A rövidebb szekvenciák kevesebb időbe telik a szintetizáláshoz és a rövidebb amplifikációs időkhöz, így csökken a DNS szennyeződésének lehetősége.

A 2. pont, A célsorozat kiválasztásakor a BLAST Search segítségével elemezze a polimorfizmusok és a szekvenálási hibák célszekvenciáját, és kerülje el azokat. Ha a célsorozatban vannak másolatú szekvenciák, akkor ez csökkenti a PCR -gép detektálási érzékenységét, és el kell kerülni.

A 3 -as, ellenőrizze a GC tartalmat ≤ 60% a célsorozatban. A magas GC-tartalom befolyásolja a célszekvencia denaturációját a termikus ciklusban, de könnyen előállítható ezt a PCR-gép nem-specifikus amplifikációját is.

A 4, Kerülje a másodlagos szerkezet előállítását. A fordított ismétlődő szekvenciákkal rendelkező célszekvenciák könnyen előállíthatók másodlagos szerkezetet, amely befolyásolja a kényelmes valós idejű PCR-gép primerek és szondák hibridizációját.

Ezen túlmenően gondoskodnunk kell arról is, hogy a sablon minősége ne befolyásolja az amplifikációt, a kényelmes valós idejű PCR-gép eredményei megbízhatóak. Például a sérült DNS -t nem lehet megfelelően amplifikálni a PCR -gépen, vagy egyáltalán nem amplifikált. Ezenkívül a DNS -polimeráz gátló reagensek (DMSO stb.) És a szennyező anyagok (SDS stb.) Jelenléte a sablonban befolyásolhatja a PCR -gép amplifikációs eredményeinek megbízhatóságát.

Valós idejű PCR-gép alapozók használata az általános PCR-hez

Kényelmes valós idejű PCR-gép primereket kap, ez a módszer használható a szokásos PCR-hez is.

Az 1. ábrán a hossznak 18-30 bp-nak kell lennie a kötés specifitásának biztosítása érdekében.

A 2. ábrán az olvadási hőmérsékletnek (TM értéknek) 55-60 ° C-nak kell lennie, és a két primer TM-értékeinek 2-3 ° C-ra kell különbözniük.

A 3. ábrán minden alapozónak 1-3 guanin vagy citozinnal kell rendelkeznie a 3 'végén, ami valós időben kényelmesen csökkentheti a nem-specifikus amplifikációt a PCR-gép során. Több mint 3 visszatér, és egy 'csúszóhatást ' okoz, ami rossz kiterjesztést eredményez.

4. A primerek GC -tartalmának 50%-nak kell lennie, a túl magas GC -tartalom növeli a TM értéket.

Az 5. ábrán a PCR -gép primereknek kerülniük kell a fordított ismétlődő szekvenciákat, mivel ez másodlagos szerkezetet alkot, amely befolyásolja a sablon alapozójának kötődését.

A 6. ábrán, ha ez RT-PCR, akkor el kell kerülnie az alapozók tervezését is, hogy az exon szekvenciákhoz kötődjenek, ami hamis pozitív PCR-gép kísérleti eredményekhez vezet. A helyes megközelítést a hosszú intron szárnyon vagy rövid intronokon, vagy az Exon-Exon csomópont régión kell megtervezni.

7. A primerek sótartalma és tisztítása.

Vegye figyelembe, hogy néha, amikor az összes pontot megtetted, a primerek nem erősülnek, ezért újraterveznie kell a primereket.

A gyors nukleinsav detektálására és a POCT gyors detektálására összpontosítva a Bioteke laboratóriumi műszereket kínál: vírusmintavételi gyűjtés, automatikus nukleinsav -extraháló, PCR gép és fertőtlenítő készülékek. És sokféle reagens és készlet is biztosít.